什么是RT-PCR它与常规的PCR有何区别
在现代生物技术领域，聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一项革命性的技术，由Kary Mullis于1985年发明。这项技术能够无限放大特定序列的DNA或RNA分子，使得从极少量样本中提取足够多的材料用于进一步分析成为可能。随着时间的推移，基于PCR原理的一种改进版本——逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）出现了，这种方法可以同时进行RNA到cDNA的转录和后续的DNA复制，从而实现对基因表达水平的一系列研究。
常规PCR
首先，我们来了解一下常规的聚合酶链反应（简称为“标准”或“传统”PCR）。这个过程通常包括以下几个步骤：
初步-denaturation：这部分涉及到样本中的双螺旋结构被分解成单链。温度升至一个适宜值，以便使双螺旋完全打开。
扩增：在这个阶段，热稳定型聚合酶将引物与模板DNA结合，并开始复制目标片段。这是一个关键步骤，因为它决定了最终产出的产品数量以及其纯度。
末端-denaturation：此阶段目的是为了准备下一次循环，即清除所有产生在上一步扩增过程中形成的新生成核苷酸三磷酸盐和二磷酸盐。
冷却/扩增：最后一步完成了整个循环。在这里，温度逐渐降低以允许新的核苷酸配体结合至模板上，并且使得延伸发生，即继续增加新的核苷酸到每个延伸单链上。这种温控策略对于确保高效率和准确性至关重要。
RT-PCR
现在，让我们深入探讨RT-PCR，它是基于常规PCRs基础上的一个变体，但它具有不同的起点，因为它不直接操作已知存在于细胞中的DNA，而是专注于检测、测定或克隆RNA分子。RT-PCR主要包括两个主要部分：
逆转录
首先，在RT-PCRs中需要进行一系列特殊处理来将RNA转换为可通过标准PCRs方法复制和放大的cDNA形式。这通常涉及使用特定的反向转录酶，如M-MuLV反向转录酶，将引物与启动子区域相结合，然后利用这些化学活化剂去触发翻译反应，从而创建带有五-carbon sugar (ribose) 和含氮碱基组成的一个新的单链m-RNA molecule，这就是所谓的人工构建后的cDNA分子。
PCR扩增
一旦得到cDNA分子的结果，就可以进入标准PCRs流程，该流程类似于前面描述过的情形。但由于已经拥有了可供复制的大量信息，因此接下来就能像之前那样重复执行denaturation、annealing、extension等各个阶段直到达到预期数量。此时，可以通过各种方法如电泳分析、荧光计数器等来评估是否成功地放大并鉴定出目的片段。
区别
两者之间最显著差异在于它们如何处理原始样本。在普通PCRs的情况下，你直接使用已经存在于细胞中的双股 DNA 分子。而在 RT-PCRs 中，你必须首先将 RNA 转换成 cDNA，这意味着你要添加额外的一步——即逆转录过程。不过，一旦你完成这一过程，你就可以用相同的心态继续执行 PCRS 的其他部分，因为你实际上是在操作 DNA 分子，而不是 RNA 分子。你也会注意到一些实验室用品，比如引物设计，它们对两种技术都是必不可少的；然而，与之相关联的是，对待不同类型样品采用的策略也会有所不同—例如，在选择正确大小和范围内适当设计引物方面，以及考虑 RNA 折叠结构对 PCR 效率影响的事项。
总结来说，无论是普通还是逆转记录，都属于非常强大的工具，每一种都根据其独有的优势被广泛应用到了科学研究和医疗诊断领域。如果你想探索更多关于这两者的细节，或许需要深入了解具体应用场景以及最新发展及其潜力。不过，有一点确定的是，无论是在遗传学研究还是疾病诊断方面，都没有比这些工具更好的方式来获取关于基因表达情况的手段了。
